核酸(suan)定(ding)量(liang)檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)實(shi)驗(yan)前準備(bei)工(gong)作

　　核酸(suan)定(ding)量(liang)檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)（如熒(ying)光(guang)染(ran)料(liao)法(fa)、探針(zhen)法(fa)或(huo)數(shu)字(zi)PCR試(shi)劑(ji)）是分(fen)子生物學實(shi)驗(yan)中的核心工(gong)具，其使(shi)用規(gui)範(fan)直(zhi)接影(ying)響(xiang)實(shi)驗(yan)結果的準(zhun)確(que)性和(he)可(ke)靠(kao)性(xing)。以下是詳(xiang)細(xi)的操作(zuo)規(gui)範(fan)和(he)註(zhu)意(yi)事項(xiang)：

　　壹(yi)、核酸(suan)定(ding)量(liang)檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)實(shi)驗(yan)前準備(bei)：

　　1.試(shi)劑(ji)與(yu)材料(liao)檢(jian)查

　　試(shi)劑(ji)完(wan)整性：確(que)認試(shi)劑(ji)盒組件(jian)完(wan)整（如反應液(ye)、酶、陽性(xing)對(dui)照(zhao)、陰(yin)性對(dui)照、標(biao)準(zhun)品等），無(wu)泄漏或(huo)汙(wu)染(ran)。

　　儲存(cun)條件：確保試(shi)劑(ji)未過(guo)期(qi)，儲存(cun)溫(wen)度符(fu)合(he)要求(qiu)（如-20℃避光(guang)保存(cun)，部分需冷藏或(huo)冷(leng)凍）。

　　耗材滅(mie)菌：使(shi)用無菌(jun)離(li)心管(guan)、吸(xi)頭(tou)、PCR管(guan)等，避(bi)免核酸(suan)汙(wu)染(ran)。

　　2.儀器(qi)校準(zhun)與(yu)維護(hu)

　　PCR儀：校準(zhun)溫(wen)度準(zhun)確(que)性。

　　熒光檢(jian)測(ce)儀：設置(zhi)正(zheng)確的激(ji)發(fa)/發(fa)射波長，調整增(zeng)益值(zhi)。

　　移液(ye)器(qi)：校準(zhun)移(yi)液(ye)體積(ji)，建(jian)議使(shi)用帶濾(lv)芯(xin)吸(xi)頭(tou)避免交(jiao)叉汙染(ran)。

　　3.實(shi)驗(yan)設計

　　對照組設(she)置(zhi)：

　　陽性(xing)對(dui)照(zhao)：已(yi)知濃度的靶核酸(suan)（驗(yan)證試(shi)劑(ji)有效(xiao)性(xing)）。

　　陰(yin)性對(dui)照：無(wu)模(mo)板空(kong)白(bai)（檢(jian)測(ce)汙(wu)染(ran)或(huo)假(jia)陽性(xing)）。

　　標(biao)準(zhun)曲線(xian)：至(zhi)少(shao)5個梯度濃度標(biao)準(zhun)品，用於定(ding)量(liang)計算(suan)。

　　樣(yang)本處理(li)：提取(qu)核酸(suan)後(hou)測濃度，確(que)保純度達標(biao)。

　　二(er)、核酸(suan)定(ding)量(liang)檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)操作(zuo)規(gui)範(fan)：

　　1.反應體系配制

　　冰上(shang)操作(zuo)：在(zai)低(di)溫(wen)環(huan)境(jing)中(zhong)配制預(yu)混(hun)液(ye)，減(jian)少(shao)非(fei)特異(yi)性(xing)擴(kuo)增(zeng)。

　　精(jing)準(zhun)加(jia)樣(yang)：按試(shi)劑(ji)盒說(shuo)明(ming)書(shu)添加(jia)各組(zu)分（如(ru)模板DNA、引(yin)物(wu)、探針(zhen)、熒(ying)光染(ran)料(liao)），建(jian)議先(xian)配制標(biao)準(zhun)品再處理(li)樣(yang)本。

　　避免氣(qi)泡(pao)：混勻後(hou)短(duan)暫離(li)心，確保反應液(ye)集(ji)中(zhong)於管(guan)底。

　　2.PCR擴(kuo)增(zeng)

　　循(xun)環參數(shu)：嚴(yan)格遵循(xun)試(shi)劑(ji)盒推薦(jian)的循(xun)環條(tiao)件。

　　熒(ying)光采(cai)集(ji)：在(zai)退(tui)火(huo)或(huo)延伸(shen)步驟(zhou)末(mo)尾(wei)檢(jian)測(ce)熒(ying)光(guang)信號(hao)（避(bi)免信(xin)號(hao)飽(bao)和(he)）。

　　防(fang)汙(wu)染(ran)措施：

　　分區操作(zuo)（試(shi)劑(ji)配制區(qu)、加(jia)樣(yang)區、PCR產(chan)物(wu)分(fen)析(xi)區(qu)）。

　　使(shi)用紫(zi)外(wai)燈或(huo)核酸(suan)清(qing)除劑(ji)定(ding)期(qi)消毒(du)實(shi)驗(yan)臺。

　　3.數據分析(xi)

　　基(ji)線(xian)校正(zheng)：選(xuan)擇(ze)指數(shu)擴(kuo)增(zeng)階段(duan)的熒(ying)光(guang)信號(hao)作(zuo)為分(fen)析(xi)窗口。

　　閾(yu)值設定(ding)：手(shou)動或(huo)自(zi)動設(she)定(ding)閾(yu)值，確保標(biao)準(zhun)品和(he)樣(yang)本的Ct值(zhi)在(zai)合(he)理(li)範(fan)圍(wei)內。

　　標(biao)準(zhun)曲線(xian)法(fa)：

　　以標(biao)準(zhun)品濃度的對(dui)數(shu)為橫(heng)坐(zuo)標(biao)，Ct值(zhi)為縱(zong)坐(zuo)標(biao)，擬(ni)合線(xian)性(xing)方(fang)程。

　　根據(ju)樣(yang)本Ct值代(dai)入方(fang)程計算(suan)靶核酸(suan)濃度。

　　結果驗(yan)證(zheng)：

　　陽性(xing)對(dui)照(zhao)應呈(cheng)現(xian)典(dian)型(xing)擴(kuo)增(zeng)曲線(xian)，陰(yin)性對(dui)照無(wu)信(xin)號(hao)。

　　重復實(shi)驗(yan)至少(shao)2次，確(que)保數據可重復性(xing)。