蛋白(bai)質(zhi)表達(da)、分(fen)離、純(chun)化(hua)步(bu)驟(zhou)

　　蛋白(bai)質(zhi)表達(da)、分(fen)離、純(chun)化(hua)可(ke)以(yi)：
 

　　(1)探索(suo)和(he)研(yan)究基因(yin)的(de)功(gong)能以(yi)及基因(yin)表達(da)調(tiao)控的(de)機理；
 

　　(2)供作結(jie)構與功(gong)能的(de)研(yan)究；
 

　　(3)作(zuo)為(wei)催化劑(ji)、營養(yang)劑(ji)等。
 

　　實(shi)驗步驟(zhou)：
 

　　壹(yi)：材料準(zhun)備(bei)
 

　　1. 實(shi)驗材料：大腸(chang)桿(gan)菌(jun) BL21、LB 液(ye)體培養(yang)基、氨(an)芐(bian)青(qing)黴(mei)素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸(zheng)餾(liu)水、胰(yi)蛋白(bai)腖(dong)、酵(jiao)母(mu)粉、氯化鈉(na)
 

　　2. 實(shi)驗儀器(qi)：搖床、離心(xin)機、層析柱(zhu)、離心(xin)管(guan)、移(yi)液(ye)槍(qiang)、槍(qiang)頭盒(he)、燒(shao)杯(bei)、玻(bo)璃棒
 

　　二(er)：實(shi)驗操作(zuo)
 

　　1. 試劑(ji)準備(bei)
 

　　2. 獲得目(mu)的(de)基因(yin)
 

　　① PCR 方(fang)法：以(yi)含(han)目(mu)的(de)基因(yin)的(de)克(ke)隆(long)質(zhi)粒(li)為(wei)模(mo)板(ban)，按基因(yin)序(xu)列(lie)設(she)計壹(yi)對(dui)引物(在(zai)上遊(you)和(he)下(xia)遊(you)引物分(fen)別引入不(bu)同的酶(mei)切(qie)位點)，PCR 循(xun)環獲得所(suo)需(xu)基因(yin)片段。
 

　　② 通(tong)過(guo) RT-PCR 方(fang)法：用(yong) TRIzol 法(fa)從細胞(bao)或組(zu)織(zhi)中(zhong)提取(qu)總 RNA，以(yi) mRNA 為(wei)模(mo)板(ban)，逆轉錄形(xing)成 cDNA 第壹(yi)鏈，以(yi)逆轉錄產物為(wei)模(mo)板(ban)進行 PCR 循(xun)環(huan)獲得產物。
 

　　3. 構建(jian)重(zhong)組(zu)表達(da)載(zai)體
 

　　① 載(zai)體酶(mei)切(qie)：將表達(da)質(zhi)粒(li)用(yong)限制性內(nei)切酶(mei)(同(tong)引物的(de)酶(mei)切(qie)位點)進(jin)行雙(shuang)酶(mei)切(qie)，酶(mei)切(qie)產物行瓊脂(zhi)糖(tang)電泳(yong)後，用(yong)膠(jiao)回(hui)收 Kit 或凍融(rong)法(fa)回收載(zai)體大片段。
 

　　② PCR 產(chan)物雙(shuang)酶(mei)切(qie)後回收，在 T4DNA 連接(jie)酶(mei)作(zuo)用(yong)下(xia)連接(jie)入載(zai)體。
 

　　4. 獲得含(han)重(zhong)組(zu)表達(da)質(zhi)粒(li)的表達(da)菌(jun)種(zhong)
 

　　① 將連(lian)接(jie)產(chan)物轉化大腸(chang)桿(gan)菌(jun) DH5α，根據(ju)重(zhong)組(zu)載(zai)體的標(biao)誌(zhi)(抗(kang) Amp 或(huo)藍(lan)白(bai)斑)作篩選，挑取(qu)單斑，堿(jian)裂(lie)解(jie)法小量(liang)抽提質(zhi)粒(li)，雙(shuang)酶(mei)切(qie)初步鑒定。
 

　　② 測序(xu)驗證目(mu)的(de)基因(yin)的(de)插入方(fang)向及閱(yue)讀(du)框(kuang)架(jia)均正(zheng)確(que)， 進入下(xia)步操(cao)作。否則應(ying)篩(shai)選更多克(ke)隆(long)，重(zhong)復亞克(ke)隆(long)或(huo)亞克(ke)隆(long)至(zhi)不(bu)同酶(mei)切(qie)位點。
 

　　③ 以(yi)此重(zhong)組(zu)質(zhi)粒(li) DNA 轉化表達(da)宿(xiu)主菌(jun)的感受態(tai)細胞(bao)。
 

　　5. 氯黴(mei)素酰(xian)基轉移(yi)酶(mei)重(zhong)組(zu)蛋白(bai)的(de)誘(you)導
 

　　① 接(jie)種(zhong)含(han)有重(zhong)組(zu)氯黴(mei)素酰(xian)基轉移(yi)酶(mei)蛋白(bai)的(de)大腸(chang)桿(gan)菌(jun) BL21 菌(jun)株於(yu) 5 mL LB 液(ye)體培養(yang)基中(zhong)(含(han) 100 ug/mL 氨芐青(qing)黴(mei)素)，37 ℃ 震(zhen)蕩(dang)培養(yang)過夜(ye)。
 

　　② 按 1∶50 或(huo) 1：100 的比例(li)稀釋過(guo)夜(ye)菌(jun)，壹(yi)般(ban)轉接 1 mL 過夜(ye)培養(yang)物於(yu) 100 mL(含(han) 100 ug/mL 氨芐青(qing)黴(mei)素)LB 液(ye)體培養(yang)基中(zhong)，37℃ 震(zhen)蕩培養(yang)至 OD600 = 0.6 - 0.8(最(zui)好(hao) 0.6，大約需(xu) 3 h)。取(qu) 10 ul 樣品(pin)用(yong)於(yu) SDS-PAGE 分(fen)析。
 

　　③ 對(dui)照(zhao)組(zu)不(bu)加誘(you)導劑(ji)，實(shi)驗組(zu)加入 IPTG 至(zhi)終濃(nong)度 0.5 mmol/l，37℃ 繼續(xu)培養(yang) 1-3 h。
 

　　④ 12 000 rpm 離心(xin) 10 min，棄(qi)上清，菌(jun)體沈(chen)澱保存(cun)於(yu) -20 ℃ 或(huo) -70 ℃ 冰(bing)箱(xiang)中(zhong)。
 

　　6. 氯黴(mei)素酰(xian)基轉移(yi)酶(mei)重(zhong)組(zu)蛋白(bai)的(de)分(fen)離、純(chun)化(hua)
 

　　① NTA 層析柱(zhu)的(de)準備：在(zai)層析柱(zhu)中(zhong)加入 1 mL NTA 介(jie)質(zhi)，並(bing)分(fen)別用(yong) 8 mL 去離子水，8 mL 上樣緩(huan)沖(chong)液(ye)洗(xi)滌。
 

　　② 重(zhong)組(zu)蛋白(bai)的(de)變性裂(lie)解(jie)：在冰(bing)浴(yu)中(zhong)凍(dong)融菌(jun)體沈(chen)澱，加入 5 mL 上樣緩(huan)沖(chong)液(ye)， 用(yong)吸(xi)管抽(chou)吸(xi)重(zhong)懸(xuan)，超聲(sheng)波(bo)破裂(lie)菌(jun)體，用(yong)振(zhen)蕩器(qi)等輕柔(rou)的(de)混勻(yun)樣品(pin) 60 min，4℃ 12000 rpm 離心(xin) 30 min，將上清吸(xi)至壹(yi)個幹凈(jing)的容器(qi)中，並(bing)棄(qi)沈(chen)澱。取(qu) 10 ul 上清樣(yang)品(pin)用(yong)於(yu) SDS-PAGE 分(fen)析。
 

　　③ 上清樣(yang)品(pin)以(yi) 10-15 mL/h 流(liu)速上 Ni2+-NTA 柱，收集流(liu)出液(ye)，取(qu) 10 ul 樣品(pin)用(yong)於(yu) SDS-PAGE 分(fen)析。
 

　　④ 洗(xi)脫雜蛋白(bai)：用(yong) Washing Buffer 以(yi) 10-15 mL/h 流(liu)速洗(xi)柱，直(zhi)至 OD280 = 0.01 分(fen)步收集洗(xi)脫液(ye)，約 3-4 h，取(qu) 10 ul 洗(xi)脫開始(shi)時的樣品(pin)用(yong)於(yu) SDS-PAGE 分(fen)析。
 

　　⑤ 洗(xi)脫目(mu)標(biao)蛋白(bai)：用(yong) Elution Buffer 洗(xi)柱，收集每(mei) 1 mL 級分(fen)，分(fen)別取(qu) 10 ul 樣品(pin)用(yong)於(yu) SDS-PAGE 分(fen)析。