MICH TLX DNA建(jian)庫(ku)試(shi)劑盒(he)

表(biao) 1. 片(pian)段(duan)化 / 末端(duan)修復(fu) /dA 尾(wei)反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)

3. 吹(chui)打或(huo)振蕩混(hun)勻(yun)，並短(duan)暫離心將反(fan)應(ying)液(ye)離心至(zhi)管底(di)。
4. 按(an)下表設置(zhi)反(fan)應(ying)程序(xu)(熱蓋(gai)設(she)置(zhi)為(wei) 82℃)  ，將上(shang)述(shu) PCR 管置於 PCR 儀中反(fan)應(ying)。

表(biao) 2. 片(pian)段(duan)化 / 末端(duan)修復(fu) / 加(jia) dA 尾(wei)反(fan)應(ying)程序(xu)

 接(jie)頭連接(jie)(Adapter Ligation)
1. 將所需(xu)試劑(ji)解凍(dong)後顛(dian)倒(dao)混(hun)勻(yun)，置於冰上(shang)備用(yong)。
2. 如下表(biao)所示配(pei)制(zhi)反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)。

表(biao) 3. 接(jie)頭連接(jie)反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)(接(jie)頭詳(xiang)細(xi)說明(ming)見(jian)註(zhu)意(yi)事項(xiang) 二)

3、吹(chui)打或(huo)振蕩混(hun)勻(yun)，並短(duan)暫離心將反(fan)應(ying)液(ye)離心至(zhi)管底(di)。
4、將上(shang)述(shu) PCR 管置於 PCR 儀中 22℃，孵育 60min。
【註(zhu)】：當(dang)投入(ru) DNA 量(liang)較低(di)，實(shi)驗效果(guo)不(bu)理想(xiang)時，可嘗試將連接(jie)時間(jian)延長。

連接(jie)產物磁珠純(chun)化(Post Ligation Clean Up)
A. 產物純化操(cao)作(zuo)步驟(zhou)(必選)
1、準備(bei)工(gong)作(zuo)：將 AMPure XP Beads 室(shi)溫平(ping)衡 30 min。配(pei)制(zhi) 80% 乙(yi)醇(chun)。
2、吸(xi)取 48 μL AMPure XP Beads   (1 .2×，Beads:DNA=1.2:1)  至(zhi)接(jie)頭連接(jie)產物中，  渦(wo)旋(xuan)混(hun) 勻(yun)或移(yi)液(ye)器(qi)吹(chui)打 10 次(ci)混(hun)勻(yun)，室(shi)溫孵育 5 min。
3、短(duan)暫離心並置(zhi)於磁力架上(shang)，待溶(rong)液(ye)澄清(qing)後(約(yue) 5 min)，棄上(shang)清(qing)。
4、保(bao)持 PCR 管始終置於磁力架中，加(jia)入 200 μL 新(xin)鮮配(pei)制(zhi)的(de) 80% 乙(yi)醇(chun)漂洗(xi)磁珠，室(shi)溫孵育30 sec，棄上(shang)清(qing)。
5、重(zhong)復(fu)步(bu)驟(zhou) 4。
6、保(bao)持 PCR 管始終置於磁力架中，開(kai)蓋(gai)幹(gan)燥(zao)磁珠至(zhi)剛(gang)出現龜(gui)裂(lie)(約(yue) 5 min)*。
7、   
1)  如產物無需(xu)進行片(pian)段(duan)分(fen)選，將 PCR 管從(cong)磁力架中取(qu)出，磁珠 ( 無(wu)需(xu)用(yong)水(shui)洗(xi)脫(tuo) ) 直(zhi)接(jie)用(yong)於文庫(ku)擴(kuo)增(zeng)步(bu)驟(zhou)反(fan)應(ying)。

2)  如產物需(xu)進行雙輪分(fen)選，  加(jia)入 52-102 μL Nuclease-free Water，渦(wo)旋(xuan)振(zhen)蕩或輕(qing)輕(qing)吹(chui)打至(zhi)充分(fen)混(hun)勻(yun)，室(shi)溫靜置 5 min。將 PCR 管短(duan)暫離心並置(zhi)於磁力架中靜置，待溶(rong)液(ye)澄清(qing) 後(約(yue) 5 min)  ，小(xiao)心移取(qu) 50-100 μL 上(shang)清(qing)至(zhi)新 PCR 管(guan)中，切(qie)勿(wu)觸碰(peng)磁珠(洗(xi)脫(tuo)體(ti)積(ji)越(yue)大(da)，洗(xi)脫(tuo)效率越(yue)高(gao)，分選效果(guo)越(yue)好(hao)，詳(xiang)細(xi)說明(ming)見(jian)註(zhu)意(yi)事項(xiang)）。
* 等待磁珠幹(gan)燥(zao)過程中，可配(pei)制(zhi) 文(wen)庫(ku)擴(kuo)增(zeng)步(bu)驟(zhou)反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)。


B. 雙輪分(fen)選操(cao)作(zuo)步驟(zhou)(可選)
1、準備(bei)工(gong)作(zuo)：將 AMPure XP Beads 室(shi)溫平(ping)衡 30 min。配(pei)制(zhi) 80% 乙(yi)醇(chun)。
2、根(gen)據 DNA 片(pian)段(duan)長(chang)度要求，參(can)考(kao)表(biao) 4 向(xiang)純(chun)化產物中加(jia)入第(di)壹輪(lun)分選磁珠，渦(wo)旋(xuan)混(hun)勻(yun)或移(yi)液(ye) 器(qi)吹(chui)打 10 次(ci)混(hun)勻(yun)。

表(biao) 4 文(wen)庫(ku)雙篩對(dui)應(ying)磁珠體(ti)積(ji)參(can)照(zhao)表(biao)

【註(zhu)】：表(biao)中“0.7×”表(biao)示樣品(pin) DNA 體(ti)積(ji)的 0.7 倍(bei)。如文庫(ku)插入片(pian)段(duan)長(chang)度為(wei) 200 bp，樣(yang)品(pin) DNA 體(ti)積(ji)為(wei) 100 μL，則(ze)第(di)壹(yi)輪(lun)分(fen)選磁珠使用(yong)體(ti)積(ji)為(wei) 0.70×100 μL=70 μL；第(di)二輪分(fen)選磁珠使用(yong)體(ti)積(ji)為(wei) 0.25×100 μL=25 μL。

3、室(shi)溫孵育 5min。將 PCR 管短(duan)暫離心並置(zhi)於磁力架中，待溶(rong)液(ye)澄清(qing)後(約(yue) 5 min)  ，小(xiao) 心轉移(yi)上(shang)清(qing)到(dao)幹(gan)凈(jing)的(de) PCR 管(guan)中。
4、參(can)考(kao)表(biao) 4 向(xiang)上(shang)清(qing)中加(jia)入第(di)二輪分(fen)選磁珠。渦(wo)旋(xuan)混(hun)勻(yun)或移(yi)液(ye)器(qi)吹(chui)打 10 次(ci)混(hun)勻(yun)，室(shi)溫靜置 5 min。
5、 將 PCR 管短(duan)暫離心並置(zhi)於磁力架中，待溶(rong)液(ye)澄清(qing)後(約(yue) 5 min)，棄上(shang)清(qing)。
6、保(bao)持 PCR 管始終處(chu)於磁力架中，加(jia)入 200 μL 新(xin)鮮配(pei)制(zhi)的(de) 80% 乙(yi)醇(chun)漂洗(xi)磁珠，室(shi)溫孵育30 sec，棄上(shang)清(qing)。
7、重(zhong)復(fu)步(bu)驟(zhou) 6。
8、保(bao)持 PCR 管始終處(chu)於磁力架中，開(kai)蓋(gai)幹(gan)燥(zao)磁珠至(zhi)剛(gang)出現龜(gui)裂(lie)(約(yue) 5 min)*。
9、將 PCR 管從(cong)磁力架中取(qu)出，磁珠 ( 無(wu)需(xu)用(yong)水(shui)洗(xi)脫(tuo) ) 直(zhi)接(jie)用(yong)於文庫(ku)擴(kuo)增(zeng)實(shi)驗。
* 等待磁珠幹(gan)燥(zao)過程中，可配(pei)制(zhi) 文(wen)庫(ku)擴(kuo)增(zeng)步(bu)驟(zhou)反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)。


文(wen)庫(ku)擴(kuo)增(zeng)(Library Amplification)
1、將表 5 所需(xu)試劑(ji)解凍(dong)後顛(dian)倒(dao)混(hun)勻(yun)，置於冰上(shang)備用(yong)。
2、如下表(biao)所示配(pei)制(zhi)反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)。

表(biao) 5 文(wen)庫(ku)擴(kuo)增(zeng)反(fan)應(ying)體(ti)系(xi) 

【註(zhu)】：  含(han)有(you) Index 的(de) PCR 引(yin)物(i5 Prmier 和(he) i7 Primer)  信(xin)息(xi)詳(xiang)見(jian) MichTM TLX Primer Kit(Catalog #NGS CD-0602-C)說(shuo)明(ming)。

3、將配(pei)置(zhi)好(hao)的(de) PCR 反(fan)應(ying)液(ye)加(jia)入到(dao) 3.3.1 或(huo) 3.3.2 步驟(zhou)完成後的(de)含(han)有(you)磁珠的(de) PCR 管(guan)中，  吹(chui)打或(huo) 振蕩混(hun)勻(yun)，並短(duan)暫離心。
4、按(an)下表設置(zhi)反(fan)應(ying)程序(xu)，將上(shang)述(shu) PCR 管置於 PCR 儀中反(fan)應(ying)。

表(biao) 6 PCR 擴(kuo)增(zeng)反(fan)應(ying)程序(xu)

產物磁珠純(chun)化(Post Amplification Clean Up)
同(tong)：產物純化操(cao)作(zuo)步驟(zhou)。使用(yong) AMPure XP Beads(1×，Beads:DNA=1:1)  純(chun)化文庫(ku)擴(kuo)增(zeng)產物，  最(zui)後加(jia)適量(liang) Nuclease-free water(20-50 μL)  進(jin)行洗(xi)脫(tuo)(產物如需(xu)保存(cun)請 使用(yong) TE Buffer 洗(xi)脫(tuo))。

文(wen)庫(ku)質量控(kong)制(zhi)
通常情況下，構(gou)建(jian)好(hao)的(de)文(wen)庫(ku)可通過濃(nong)度檢測(ce)和(he)長度分布檢測(ce)來(lai)進(jin)行質量評價(jia)，具(ju)體(ti)請(qing)參(can)見(jian)：註(zhu)意(yi)事項(xiang)中的(de)關(guan)於文庫(ku)質檢。

註(zhu)意(yi)事項(xiang)
關(guan)於操(cao)作(zuo)
1、請(qing)穿實(shi)驗服並戴(dai)壹次(ci)性(xing)手套進(jin)行實(shi)驗。
2、使用(yong)前(qian)請將試劑(ji)盒(he)各(ge)組分(fen)置於室(shi)溫解(jie)凍(dong)。解凍(dong)後充(chong)分(fen)混(hun)勻(yun)，短暫(zan)離心後置(zhi)於冰上(shang)待用(yong)。
3、混(hun)勻(yun)時請輕(qing)輕(qing)吹(chui)打或(huo)輕(qing)輕(qing)振蕩(dang)，劇烈振蕩可能(neng)會(hui)造(zao)成文庫(ku)產出下降。
4、為(wei)避免樣品(pin)交(jiao)叉(cha)汙(wu)染，推(tui)薦使用(yong)帶(dai)濾(lv)芯(xin)的(de)壹次性槍(qiang)頭。
5、推(tui)薦在(zai)帶(dai)熱(re)蓋(gai)的(de) PCR 儀(yi)中進(jin)行各(ge)步(bu)驟(zhou)反(fan)應(ying)，使用(yong)前(qian)應(ying)預(yu)熱(re)PCR 儀(yi)至(zhi)反(fan)應(ying)溫(wen)度附近。
6、請(qing)在(zai)潔凈(jing)的(de)實(shi)驗環(huan)境下實(shi)驗，避(bi)免汙(wu)染。

TLX Adapter for ILM 說明(ming)
1、TLX Adapter for ILM 采(cai)用(yong)短(duan)接(jie)頭模(mo)式。
2、接(jie)頭濃(nong)度：15 μM; 直(zhi)接(jie)用(yong)於相(xiang)應(ying)建(jian)庫(ku)試(shi)劑盒(he)連接(jie)體(ti)系裏(li)即可。
3、-20℃保(bao)存，使用(yong)前(qian)提前(qian)融(rong)化，盡量(liang)低(di)溫(wen)融(rong)化，避免(mian)在(zai)超過 30℃的環(huan)境中融(rong)化。
4、建(jian)庫(ku)推(tui)薦使用(yong)量(liang)：常規(gui) DNA 投入(ru)量 100-200 ng, 2 μL/rxns；其他(ta) DNA 投入(ru)量需(xu)要適當(dang)調 整接(jie)頭使用(yong)量(liang)。

關(guan)於磁珠純(chun)化與(yu)分(fen)選
1、DNA 片(pian)段(duan)選擇(ze)步(bu)驟(zhou)可在(zai)接(jie)頭連接(jie)後或(huo)文(wen)庫(ku)擴(kuo)增(zeng)後進(jin)行。
2、當 Input DNA 質量≥ 50 ng，  建(jian)議在(zai)接(jie)頭連接(jie)後分(fen)選；  如 Input DNA 質量<50 ng，  可在(zai) 文庫(ku)擴(kuo)增(zeng)後進(jin)行分選。
3、TLX Ligase Buffer 包含(han)高(gao)濃(nong)度的 PEG，對雙輪磁珠分(fen)選產生顯(xian)著(zhu)影響。因此(ci)，當在(zai)接(jie)頭 連接(jie)後進(jin)行片(pian)段(duan)選擇(ze)，須(xu)先(xian)進(jin)行純化步驟(zhou)，再進(jin)行雙輪分(fen)選步(bu)驟(zhou)；如在(zai)文庫(ku)擴(kuo)增(zeng)後進(jin)行片(pian) 段(duan)選擇(ze)，可直(zhi)接(jie)進(jin)行雙輪磁珠分(fen)選步(bu)驟(zhou)。
4、磁珠使用(yong)前(qian)應(ying)先(xian)平(ping)衡至(zhi)室(shi)溫，並(bing)混(hun)勻(yun)再使用(yong)，否(fou)則(ze)會(hui)導致得(de)率下降。
5、80% 乙(yi)醇(chun)應(ying)現(xian)用(yong)現(xian)配(pei)，否(fou)則(ze)將影響(xiang)回(hui)收效率。
6、進(jin)行片(pian)段(duan)選擇(ze)時， 初始樣(yang)品(pin)體(ti)積(ji)應(ying)盡(jin)量(liang)≥ 100 μL， 初(chu)始樣(yang)本體積(ji)越(yue)大(da)， 片(pian)段(duan)選擇(ze)效果(guo)越(yue)好(hao)。

關(guan)於文庫(ku)擴(kuo)增(zeng)
1、文(wen)庫(ku)擴(kuo)增(zeng)循環(huan)數與(yu)文(wen)庫(ku)產量和(he)文庫(ku)質量有直(zhi)接(jie)關(guan)系，請(qing)參(can)照(zhao)下(xia)表(biao)列(lie)舉(ju)的本試劑盒(he)設(she)置(zhi)擴(kuo)增(zeng) 循環(huan)數，並(bing)摸索(suo)合(he)適的(de)循環(huan)數。

表(biao) 1. 文(wen)庫(ku)擴(kuo)增(zeng)循環(huan)數參(can)照(zhao)表(biao)

【註(zhu)】：如文庫(ku)擴(kuo)增(zeng)後需(xu)要做片(pian)段(duan)選擇(ze)時參(can)照(zhao)較高(gao)循環(huan)數擴(kuo)增(zeng)。

關(guan)於文庫(ku)質檢
1、通常情況下，構(gou)建(jian)好(hao)的(de)文(wen)庫(ku)可通過長度分布檢測(ce)和(he)濃(nong)度檢測(ce)來(lai)進(jin)行質量評價(jia)。
2、文(wen)庫(ku)濃(nong)度檢測(ce)可使用(yong)：基(ji)於雙鏈 DNA 熒(ying)光染料的(de)方法， 如 Qubit® 或 qPCR 絕對(dui)定(ding)量的方法。
3、文(wen)庫(ku)長(chang)度分布檢測(ce)，可通過 Agilent Bioanalyzer 2100 等基(ji)於毛(mao)細管(guan)電(dian)泳或微(wei)控(kong)流原(yuan)理的(de) 設備進行檢測(ce)。

運(yun)輸與(yu)保(bao)存方法

 -20℃運(yun)輸。
所有組分(fen) -20° C 保存，有效期 1 年。

MICH TLX DNA建(jian)庫(ku)試(shi)劑盒(he)產品(pin)信(xin)息(xi)