蛋(dan)白(bai)定量(liang)檢測(ce)試(shi)劑(ji)的作(zuo)用是(shi)快(kuai)速(su)、準確地(di)測(ce)定溶(rong)液中蛋白(bai)質(zhi)的濃(nong)度(du)。 壹(yi)、核(he)心作(zuo)用與(yu)重(zhong)要(yao)性(xing)
1、標準化實驗：在(zai)許多(duo)生物(wu)學(xue)實驗中，如(ru)WesternBlot、ELISA、細(xi)胞(bao)轉(zhuan)染、蛋(dan)白(bai)質(zhi)純(chun)化等(deng)，需要(yao)確保(bao)每(mei)個反應中加(jia)入等(deng)量的蛋(dan)白(bai)質(zhi)。蛋白(bai)定量(liang)是保(bao)證實驗結果可(ke)比性(xing)、可重(zhong)復(fu)性(xing)和(he)準確性(xing)的(de)第壹(yi)步。
2、評估樣品質量：在(zai)蛋白(bai)質(zhi)純(chun)化過(guo)程(cheng)中，通過測(ce)定不(bu)同(tong)步驟中蛋白(bai)質(zhi)的濃(nong)度(du)，可以(yi)計(ji)算(suan)回(hui)收(shou)率、純(chun)化倍(bei)數，從而(er)評(ping)估純(chun)化方(fang)法(fa)的(de)效率。
3、診斷(duan)與(yu)醫療(liao)應用：在(zai)臨床檢驗中，測(ce)定血(xue)液、尿(niao)液等體(ti)液中的特定蛋(dan)白(bai)質(zhi)（如(ru)白(bai)蛋(dan)白(bai)、免(mian)疫球(qiu)蛋白(bai)）濃(nong)度(du)，是診斷(duan)多(duo)種疾(ji)病（如(ru)肝(gan)腎功能(neng)異常、營(ying)養狀(zhuang)況、免疫疾病(bing)）的重(zhong)要(yao)指(zhi)標。
二(er)、工(gong)作(zuo)原理
蛋(dan)白(bai)定量(liang)試劑(ji)的核(he)心原理是利(li)用蛋(dan)白(bai)質(zhi)的特定化(hua)學性(xing)質或氨(an)基(ji)酸(suan)殘(can)基(ji)與(yu)染料(liao)發(fa)生反(fan)應，產(chan)生可(ke)檢測(ce)的(de)信號(hao)（通常是顏(yan)色變(bian)化(hua)或(huo)熒光(guang)變(bian)化(hua)），這(zhe)個信號(hao)的(de)強(qiang)度與(yu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)的濃(nong)度(du)成正(zheng)比。
主要(yao)的(de)原理包括：
- 還(hai)原銅離(li)子(zi)反應：蛋白(bai)質(zhi)中的肽鍵在(zai)堿性(xing)條(tiao)件下將Cu??還原為Cu?，後(hou)者(zhe)與(yu)試(shi)劑(ji)中的其他物(wu)質(zhi)反應生成有(you)色絡(luo)合(he)物(wu)。
- 與(yu)特(te)定氨(an)基(ji)酸(suan)反(fan)應：與蛋白(bai)質(zhi)中的精(jing)氨酸(suan)、色氨(an)酸(suan)、酪氨(an)酸(suan)等(deng)芳香(xiang)族氨基(ji)酸(suan)或(huo)堿性(xing)氨(an)基(ji)酸(suan)發(fa)生反(fan)應。
- 染(ran)料(liao)結合(he)：某些(xie)染(ran)料(liao)與(yu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)結合(he)後(hou)，其(qi)吸光(guang)度或(huo)熒光(guang)性質(zhi)會(hui)發(fa)生改(gai)變(bian)。
- 紫外吸收：蛋白(bai)質(zhi)中的色氨(an)酸(suan)和(he)酪氨(an)酸(suan)在(zai)280nm處(chu)有(you)特(te)定的(de)紫外吸收峰。
三(san)、常見的(de)蛋(dan)白(bai)定量(liang)檢測(ce)方(fang)法(fa)及對(dui)應試劑(ji)
| 方法(fa)名稱(cheng) | 常用試(shi)劑(ji) | 原理 | 優(you)點(dian) | 缺點 | 適用場景 |
| BCA法(fa) | BCA試(shi)劑(ji)盒(he) | 蛋白(bai)質(zhi)在(zai)堿性(xing)環(huan)境(jing)下(xia)將(jiang)Cu²⁺還(hai)原為Cu⁺，Cu⁺與(yu)BCA試(shi)劑(ji)反應生成紫(zi)色絡(luo)合(he)物(wu)（562nm）。 | - 靈(ling)敏度(du)高(gao) | - 不(bu)同(tong)蛋(dan)白(bai)質(zhi)因(yin)氨(an)基(ji)酸(suan)組(zu)成不(bu)同(tong)，顯色有(you)差(cha)異 | 常用、通用的(de)方(fang)法(fa)之壹(yi)，尤(you)其適用於(yu)含(han)有(you)去(qu)垢劑(ji)的細(xi)胞(bao)裂(lie)解(jie)液樣品。 |
| - 抗幹擾能(neng)力強(qiang)（對去(qu)垢劑(ji)耐受性好(hao)） | - 反(fan)應時間較長 |
| - 操作(zuo)簡便(bian) | |
| Bradford法(fa) | 考(kao)馬(ma)斯亮(liang)藍(lan)G-250染(ran)料(liao) | 染(ran)料(liao)與(yu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)的堿性(xing)氨(an)基(ji)酸(suan)和(he)芳香(xiang)族氨基(ji)酸(suan)結合(he)，顏(yan)色由棕(zong)紅色變(bian)為(wei)藍(lan)色（595nm）。 | - 非(fei)常快速(su)（~5分(fen)鐘(zhong)） | - 對去(qu)垢劑(ji)非常敏感(gan)（如(ru)SDS、Triton） | 適用於(yu)成分簡單(dan)、不(bu)含(han)幹擾去垢劑(ji)的純(chun)化蛋(dan)白(bai)樣(yang)品。 |
| - 靈敏度高(gao) | - 不(bu)同(tong)蛋(dan)白(bai)質(zhi)差(cha)異大 |
| - 成(cheng)本(ben)較(jiao)低 | - 染料(liao)易(yi)附著在(zai)器皿(min)上(shang) |
| Lowry法(fa) | Folin-酚(fen)試(shi)劑(ji) | 第壹(yi)步與BCA類似（銅(tong)離(li)子(zi)反應），第二(er)步與Folin-酚試劑(ji)反應，增(zeng)強(qiang)信號(hao)。 | - 靈(ling)敏(min)度(du)高(gao)於(yu)BCA法(fa) | - 步驟繁(fan)瑣(suo) | 經(jing)典(dian)方(fang)法(fa)，現(xian)多被(bei)BCA法(fa)取(qu)代。 |
| - 幹擾物(wu)質(zhi)多 |
| - 現(xian)已較(jiao)少使(shi)用 |
| 紫(zi)外吸收法(fa) | 無特殊(shu)試(shi)劑(ji)，直(zhi)接(jie)測(ce)量(liang) | 利用蛋(dan)白(bai)質(zhi)中Trp和(he)Tyr在(zai)280nm的紫(zi)外吸收。 | - 無損樣(yang)品，可回收 | - 受核酸(suan)汙染幹(gan)擾嚴(yan)重(zhong)（核(he)酸(suan)在(zai)260nm有(you)強(qiang)吸收） | |
| - 極(ji)其(qi)快速簡便(bian) | - 需要(yao)蛋(dan)白(bai)質(zhi)含(han)有(you)芳香(xiang)族氨基(ji)酸(suan) | |
| - 無需制作(zuo)標準曲線 | | |
四、標準操作(zuo)流程(cheng)
無論使(shi)用哪種試(shi)劑(ji)，基(ji)本(ben)流(liu)程(cheng)都遵循(xun)以(yi)下(xia)步驟：
-制備(bei)標準品：用已(yi)知(zhi)濃(nong)度(du)的標準蛋白(bai)（通常是牛血清白(bai)蛋(dan)白(bai)BSA）配制壹(yi)系(xi)列梯度(du)濃(nong)度(du)的溶液。
-與(yu)試劑(ji)反應：將標準品和(he)待(dai)測(ce)樣(yang)品分別(bie)與(yu)定量(liang)試劑(ji)混合(he)，在(zai)特定溫度(du)下(xia)孵育(yu)壹(yi)定時(shi)間。
-檢(jian)測(ce)吸光(guang)度：使(shi)用酶標儀或(huo)分光(guang)光(guang)度計(ji)測(ce)量(liang)各(ge)管(guan)在(zai)特定波長下的吸光(guang)度值(zhi)。
-繪制標準曲線：以(yi)標準蛋白(bai)濃(nong)度(du)為橫坐標，吸光(guang)度值(zhi)為(wei)縱(zong)坐標，繪制標準曲線。
-計(ji)算未知(zhi)濃(nong)度(du)：將待(dai)測(ce)樣(yang)品的吸光(guang)度值(zhi)代入標準曲線的回(hui)歸方程(cheng)，計算(suan)出其蛋白(bai)質(zhi)濃(nong)度(du)。
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