體外(wai)蛋白(bai)表達試劑盒(he)實(shi)操手冊

　　壹(yi)、體外(wai)蛋白(bai)表達試劑盒(he)實(shi)驗(yan)前準(zhun)備(bei)
 

　　試劑解(jie)凍(dong)與儲(chu)存(cun)
 

　　CFPE Master Mix：從(cong)-80℃取出後置(zhi)於(yu)冰(bing)上(shang)緩慢解(jie)凍(dong)，避免(mian)反(fan)復凍(dong)融(rong)(解(jie)凍(dong)後(hou)3小時(shi)內(nei)完(wan)成實(shi)驗(yan))。
 

　　陽性對(dui)照模板(T7P-GFP或(huo)LET)：儲存(cun)於(yu)-20℃以下，解(jie)凍(dong)後(hou)同(tong)樣(yang)需冰(bing)上(shang)操作。
 

　　關(guan)鍵(jian)提示：使(shi)用(yong)無(wu)核(he)酸酶(mei)(Nuclease-Free)的(de)耗(hao)材(cai)和試劑，防止(zhi)DNA/RNA降解(jie)。
 

　　模板(ban)準(zhun)備(bei)
 

　　質粒模(mo)板：需高純度(如(ru)PCR純(chun)化試劑盒(he)處(chu)理(li))，洗脫(tuo)液使(shi)用(yong)無(wu)核(he)酸酶(mei)水(shui)，避免(mian)鹽離子幹(gan)擾(rao)反(fan)應(ying)。
 

　　線(xian)性模(mo)板(ban)：通過無(wu)縫克隆技術制(zhi)備(bei)後純(chun)化，濃度調(tiao)整至(zhi)10-100 ng/μL，確保(bao)蛋白(bai)質產量。
 

　　故(gu)障排查(zha)：若(ruo)模(mo)板(ban)含(han)核(he)酸酶(mei)或(huo)抑(yi)制(zhi)劑(如(ru)Cl⁻、SDS)，會導(dao)致(zhi)表達失敗(bai)，需重新純化模板。
 

　　二、反(fan)應(ying)體系配(pei)置(zhi)
 

　　反(fan)應(ying)體系設(she)計(ji)
 

　　總反(fan)應(ying)體積：建議(yi)10 μL(可按比例(li)放(fang)大(da))。
 

　　組(zu)分(fen)添(tian)加順(shun)序(xu)：
 

　　9 μL CFPE Master Mix(EC或(huo)ECL)；
 

　　1 μL陽性對(dui)照模板(或(huo)目標(biao)DNA模(mo)板(ban)，終(zhong)濃度10 ng/μL)；
 

　　陰(yin)性對(dui)照：9 μL Master Mix + 1 μL無(wu)核(he)酸酶(mei)水(shui)。
 

　　關鍵(jian)提示：DNA模(mo)板(ban)對(dui)濃度敏(min)感(gan)，需充(chong)分(fen)混(hun)勻(yun)，避免(mian)移液誤(wu)差(cha)。
 

　　孵(fu)育(yu)條件優化
 

　　溫度：29℃(水(shui)浴鍋(guo)或(huo)培(pei)養箱預(yu)熱至目(mu)標溫(wen)度)。
 

　　時(shi)間：16小(xiao)時(shi)(過夜孵育(yu)可提高產量)。
 

　　故(gu)障排查(zha)：若(ruo)孵(fu)育(yu)後無(wu)表達，檢(jian)查(zha)溫度是(shi)否(fou)穩定(ding)(避免(mian)冷凝(ning)水(shui)進入(ru)反(fan)應(ying)管)。
 

　　三、蛋白(bai)表達與檢(jian)測
 

　　表達驗證
 

　　SDS-PAGE電(dian)泳：取(qu)1-2 μL反(fan)應(ying)液與5×Loading Buffer混(hun)合，95℃煮沸5分(fen)鐘，跑膠檢(jian)測目(mu)標(biao)蛋白(bai)條帶。
 

　　熒(ying)光檢(jian)測：若(ruo)表達GFP等熒(ying)光蛋白(bai)，可直接用(yong)紫(zi)外(wai)燈觀察(cha)熒(ying)光信(xin)號。
 

　　故(gu)障排查(zha)：若(ruo)無(wu)條帶，檢(jian)查(zha)模板是否正(zheng)確(que)、反(fan)應(ying)體系是(shi)否汙(wu)染(ran)(如核(he)酸酶(mei)殘留)。
 

　　包涵體(ti)處(chu)理(li)
 

　　問題：原核(he)表達中常(chang)見(jian)蛋白(bai)不(bu)正(zheng)確(que)折(zhe)疊形(xing)成包(bao)涵體(ti)。
 

　　解(jie)決方(fang)案(an)：
 

　　降低(di)誘(you)導(dao)溫度(如(ru)16℃)和誘(you)導(dao)劑濃度(如(ru)0.1 mM IPTG)；
 

　　引(yin)入(ru)分(fen)子伴(ban)侶(lv)共表達；
 

　　包涵體(ti)純化後復性(常(chang)用(yong)尿素或(huo)鹽酸胍(gua)變(bian)性，再(zai)通(tong)過稀(xi)釋(shi)/透析復性)。
 

　　關(guan)鍵(jian)提示：復(fu)性需遵循“低溫、低(di)濃度、小(xiao)梯度”原(yuan)則(ze)，可添(tian)加PEG8000或(huo)精氨(an)酸提高成功率(lv)。
 

　　四(si)、蛋白(bai)純化
 

　　粗(cu)分(fen)離與層(ceng)析(xi)純化
 

　　細(xi)胞裂(lie)解(jie)：超聲破碎(功率(lv)30%，超聲3輪，每輪2次，冰(bing)上(shang)操作)或(huo)高壓勻(yun)漿。
 

　　離心過濾(lv)：12000 rpm離(li)心30分(fen)鐘，獲取(qu)上(shang)清(qing)液。
 

　　親和層析：
 

　　His標簽(qian)蛋白(bai)：用Ni-NTA瓊脂糖(tang)珠或(huo)磁(ci)珠純化，洗滌緩沖液含(han)20 mM咪唑，洗脫(tuo)緩沖液含(han)250 mM咪唑。
 

　　GST標(biao)簽(qian)蛋白(bai)：用GST瓊脂糖(tang)珠純化，洗滌緩沖液含(han)0.1% Triton，洗脫(tuo)緩沖液含(han)10 mM還原(yuan)型谷(gu)胱(guang)甘肽(tai)。
 

　　故(gu)障排查(zha)：若(ruo)純(chun)化後雜(za)蛋白(bai)多，可聯用(yong)離(li)子交(jiao)換(huan)層析(xi)(如陰(yin)/陽離(li)子交(jiao)換(huan)柱)或(huo)分(fen)子篩(凝(ning)膠過濾(lv))。
 

　　濃縮(suo)與緩沖液置(zhi)換(huan)
 

　　超濾(lv)濃縮(suo)：使(shi)用(yong)30K超濾(lv)管，4℃離心(xin)濃縮(suo)蛋白(bai)至目標體(ti)積(ji)。
 

　　脫(tuo)鹽柱置(zhi)換(huan)：將蛋白(bai)緩沖液置(zhi)換(huan)為(wei)PBS或(huo)其(qi)他(ta)適(shi)宜(yi)緩沖液。
 

　　關鍵(jian)提示：超濾(lv)時(shi)避免(mian)蛋白(bai)沈澱(可添(tian)加甘油或(huo)DTT穩定(ding)蛋白(bai))。
 

　　五、純度驗(yan)證與儲(chu)存(cun)
 

　　純度檢(jian)測
 

　　SDS-PAGE：考(kao)馬(ma)斯(si)亮藍染(ran)色(se)，目(mu)標(biao)蛋白(bai)純度應(ying)>90%。
 

　　Western Blot：用特(te)異性抗(kang)體(ti)檢(jian)測目(mu)標(biao)蛋白(bai)，減少非(fei)特(te)異性背(bei)景。
 

　　HPLC：高效(xiao)液相(xiang)色(se)譜(pu)進(jin)壹(yi)步驗(yan)證純度。
 

　　故(gu)障排查(zha)：若(ruo)純(chun)度不(bu)足(zu)，檢(jian)查(zha)純化標簽(qian)是否(fou)暴露全(如(ru)His標(biao)簽(qian)被遮(zhe)擋(dang)需優化表達條件)。
 

　　蛋白(bai)儲存
 

　　短(duan)期(qi)儲(chu)存(cun)：4℃保(bao)存(cun)(含(han)50%甘(gan)油)，避免(mian)反(fan)復凍(dong)融(rong)。
 

　　長(chang)期(qi)儲存(cun)：-80℃分(fen)裝保(bao)存(cun)，添(tian)加蛋白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑(如(ru)PMSF)防止(zhi)降解(jie)。
 

　　關鍵(jian)提示：儲(chu)存(cun)前需測定(ding)蛋白(bai)濃度(如(ru)BCA法(fa))，並記(ji)錄純度數(shu)據(ju)。
 

　　六、體(ti)外(wai)蛋白(bai)表達試劑盒(he)常(chang)見(jian)問題與解(jie)決方(fang)案(an)總結

問題	可能原(yuan)因	解(jie)決方(fang)案(an)
蛋白(bai)不(bu)表達	模板(ban)質量差(cha)、反(fan)應(ying)體系汙(wu)染(ran)	重新純化模板，使(shi)用(yong)無(wu)核(he)酸酶(mei)耗材，檢(jian)查(zha)陽性對(dui)照是否表達
包涵體(ti)形成	表達過快(kuai)、缺(que)少翻譯後修(xiu)飾	降(jiang)低誘(you)導(dao)溫度/濃度，引(yin)入(ru)分(fen)子伴(ban)侶(lv)，包涵體(ti)復性
純(chun)化後雜(za)蛋白(bai)多	純化方法單壹(yi)、標簽(qian)暴露不(bu)足(zu)	聯(lian)用多種層(ceng)析方法(fa)（如(ru)親和+離子交(jiao)換(huan)），優化表達條件使(shi)標(biao)簽(qian)充(chong)分(fen)暴露
蛋白(bai)降解(jie)	細(xi)菌(jun)蛋白(bai)酶作用(yong)、序(xu)列不(bu)穩定(ding)	全程低(di)溫操作，添(tian)加蛋白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑，檢(jian)查(zha)蛋白(bai)序列N端原(yuan)則(ze)，換(huan)用真(zhen)核(he)表達系統
儲(chu)存(cun)後蛋白(bai)活性下降	反(fan)復凍(dong)融(rong)、儲存(cun)條件不(bu)當(dang)	分(fen)裝保(bao)存(cun)，避免(mian)反(fan)復凍(dong)融(rong)，優化儲存緩沖液（如添(tian)加甘油、DTT）