蛋白(bai)定量原理(li)、方法與實(shi)驗(yan)操作(zuo)全(quan)攻略(lve)

蛋(dan)白(bai)定量是生物學(xue)、醫(yi)學(xue)和(he)生物化學(xue)研究(jiu)中的基礎(chu)實驗(yan)技術，廣(guang)泛應(ying)用於(yu)藥(yao)物研發、疾病診(zhen)斷、食(shi)品(pin)檢(jian)測等領(ling)域(yu)。準(zhun)確(que)的蛋白(bai)定量不僅能保證(zheng)實驗(yan)結果(guo)的可(ke)靠(kao)性，還能(neng)為後續研究(jiu)提供(gong)關(guan)鍵(jian)數(shu)據(ju)支(zhi)持(chi)。本文(wen)將從蛋(dan)白(bai)定量的原理(li)、常(chang)用方法、實驗(yan)操作(zuo)要(yao)點(dian)及常(chang)見問題解(jie)決方案入手(shou)，為(wei)您(nin)帶來壹(yi)篇實(shi)用且易懂的指(zhi)南。

在許多(duo)實驗(yan)中，蛋(dan)白(bai)定量是標(biao)準化(hua)樣本的關(guan)鍵(jian)步驟。例(li)如：

- 酶活性測定(ding)：需統壹(yi)蛋(dan)白(bai)濃度以比較酶活力。

- Western Blot：確(que)保上(shang)樣量壹致(zhi)，避免因蛋(dan)白(bai)量差(cha)異(yi)導致結果(guo)偏(pian)差(cha)。

- 藥(yao)物研發：精準(zhun)測(ce)定藥(yao)物靶(ba)點(dian)蛋(dan)白(bai)的表達(da)量。

- 臨床(chuang)檢(jian)測：如尿液蛋(dan)白(bai)定量輔助(zhu)腎(shen)病診(zhen)斷。
 

不同方法的原理(li)和(he)適用(yong)場(chang)景各異(yi)，需根據實(shi)驗(yan)需求選擇。

1、紫外吸(xi)收(shou)法（UV法(fa)）

- 原理(li)：蛋(dan)白(bai)質中(zhong)的酪氨(an)酸、色氨(an)酸等芳(fang)香族(zu)氨(an)基酸在280 nm處(chu)有特(te)征吸收(shou)峰(feng)。

- 優(you)點(dian)：快(kuai)速(su)、無需額外試(shi)劑(ji)，可(ke)同時(shi)檢(jian)測DNA/RNA（260 nm）。

- 缺點(dian)：

- 靈(ling)敏(min)度(du)低(di)（最(zui)低(di)檢(jian)測限(xian)約(yue)0.1 mg/mL）。

- 受(shou)雜(za)質幹(gan)擾(rao)（如核(he)酸、多(duo)糖）。

- 適用(yong)場(chang)景：粗(cu)提蛋白(bai)的快(kuai)速(su)估算(suan)。

2、Bradford法(fa)（考馬(ma)斯(si)亮藍法）

- 原理(li)：考馬(ma)斯(si)亮藍G-250與蛋白(bai)質結合後發生顏色(se)變(bian)化(hua)（藍(lan)→棕(zong)），在595 nm處(chu)吸(xi)光值(zhi)與蛋(dan)白(bai)濃度成正比。

- 優點(dian)：

- 靈(ling)敏(min)度(du)高（檢(jian)測限(xian)低(di)至(zhi)5 μg/mL）。

- 操(cao)作簡(jian)單，5-20分鐘(zhong)出(chu)結果(guo)。

- 缺點(dian)：

- 易受(shou)去汙劑(ji)、甘(gan)油(you)等(deng)幹擾(rao)。

- 不同蛋白(bai)因氨(an)基酸組成(cheng)不同，標準曲(qu)線(xian)需定(ding)制。

- 適用(yong)場(chang)景：純(chun)化(hua)蛋(dan)白(bai)的快(kuai)速(su)定量（需註(zhu)意(yi)幹(gan)擾物質）。

3、BCA法(fa)（二(er)喹(kui)啉甲酸法）

- 原理(li)：在堿性條件下，蛋白(bai)質將Cu²⁺還原為(wei)Cu⁺，後者與BCA試(shi)劑(ji)形成紫色(se)絡(luo)合物（562 nm）。

- 優點(dian)：

- 抗(kang)幹擾能(neng)力(li)強(qiang)（耐受(shou)去汙劑(ji)、還原劑(ji)）。

- 穩(wen)定(ding)性(xing)好(hao)，顏色(se)可(ke)穩(wen)定(ding)數(shu)小(xiao)時(shi)。

- 檢(jian)測範圍(wei)廣(guang)（20 μg/mL - 2 mg/mL）。

- 缺點(dian)：

- 需高溫反應(ying)（60℃孵育30分鐘）。

- 成(cheng)本較高。

- 適用場(chang)景：復(fu)雜(za)樣品(pin)（如細(xi)胞裂解(jie)液(ye)）的定量。

4、Lowry法（改良酚(fen)試(shi)劑(ji)法(fa)）

- 原理(li)：分(fen)兩步反(fan)應(ying)：

1、堿性(xing)條件下，蛋白(bai)質與(yu)Cu??形成復(fu)合物。

2、加入酚(fen)試(shi)劑(ji)（Folin-Ciocalteu），與(yu)復(fu)合物中的酪氨(an)酸反應(ying)生成藍色產物（750 nm）。

- 優點(dian)：

- 靈(ling)敏(min)度(du)高（檢(jian)測限(xian)低(di)至(zhi)5 μg/mL）。

- 適(shi)用於(yu)微(wei)量蛋白(bai)檢(jian)測。

- 缺點(dian)：

- 操(cao)作(zuo)步驟繁(fan)瑣(suo)，需精確(que)計時(shi)。

- 易受(shou)硫酸銨等(deng)試(shi)劑(ji)幹(gan)擾。

- 適(shi)用場(chang)景：稀有蛋(dan)白(bai)樣本的超微(wei)量檢(jian)測。
 

1、試(shi)劑(ji)準(zhun)備(bei)

- BCA工作液(ye)：按(an)試(shi)劑(ji)盒說(shuo)明(ming)書(shu)比例(li)混(hun)合A液（含BCA）和B液(ye)（CuSO₄），現配(pei)現用。

- 標準品(pin)：通(tong)常(chang)為BSA（牛(niu)血清白(bai)蛋白(bai)），配(pei)制梯度(du)濃度（如0-2000 μg/mL）。

2、加樣與反應(ying)

1、取潔(jie)凈試管(guan)，加(jia)入標(biao)準(zhun)品(pin)或(huo)待測(ce)樣品(pin)（10-20 μL），補足PBS至(zhi)200 μL。

2、每管(guan)加(jia)入2 mL BCA工作液(ye)，混(hun)勻。

3、60℃水浴30分鐘(zhong)（避免氣(qi)泡），冷(leng)卻至(zhi)室(shi)溫。

3、測(ce)吸光值(zhi)

- 使用(yong)酶標儀或分(fen)光光度計，在562 nm處(chu)讀(du)取(qu)吸光值(zhi)。

- 以標(biao)準品(pin)濃度為橫坐(zuo)標，吸(xi)光值(zhi)為縱(zong)坐(zuo)標繪(hui)制標準(zhun)曲線(xian)。

4、計算(suan)樣品(pin)濃度

- 根據標(biao)準曲(qu)線(xian)方程(cheng)計(ji)算樣品(pin)濃度，乘(cheng)以稀釋倍數(shu)即可(ke)。
 

1、標準(zhun)曲線(xian)線(xian)性差(cha)

- 原因：標(biao)準(zhun)品(pin)配(pei)制不準確(que)、反應(ying)時間不足或(huo)溫(wen)度不穩(wen)定(ding)。

- 解(jie)決：

- 精確(que)稱量BSA，用同(tong)批(pi)次稀釋液配(pei)制標準(zhun)品(pin)。

- 確(que)保水(shui)浴鍋(guo)溫(wen)度(du)均勻，避免邊緣(yuan)孔與(yu)中心孔(kong)溫差(cha)。

2、樣品(pin)濃度超出檢(jian)測範圍(wei)

- 原因：樣本濃度過(guo)高或過(guo)低(di)。

- 解(jie)決：

- 高濃度樣本：用(yong)稀釋液（如PBS）梯度(du)稀釋後重新檢(jian)測。

- 低(di)濃度樣本：改用更靈(ling)敏(min)的方法（如Bradford或Lowry法(fa)）。

3、重復(fu)性(xing)差(cha)

- 原因：加(jia)樣誤差(cha)、混(hun)勻不充分或(huo)反應(ying)時間不壹致。

- 解(jie)決：

- 使(shi)用移(yi)液(ye)器(qi)並定(ding)期校準(zhun)。

- 加樣後立即渦(wo)旋(xuan)混(hun)勻。

- 嚴格控(kong)制反應(ying)時間（如BCA法統壹(yi)水(shui)浴時間）。

4、幹(gan)擾(rao)物質影(ying)響

- 常(chang)見幹擾(rao)物：SDS、Triton X-100、EDTA、甘油(you)等(deng)。

- 解(jie)決：

- 選(xuan)擇抗(kang)幹擾能(neng)力(li)更強(qiang)的方法（如BCA法優(you)於(yu)Bradford法）。

- 對樣本進(jin)行預處(chu)理(li)（如丙酮(tong)沈澱(dian)去除雜(za)質）。
 

1、標準(zhun)品(pin)選(xuan)擇：優(you)先(xian)使(shi)用與(yu)待測(ce)蛋白(bai)來源(yuan)相同(tong)的標準(zhun)品(pin)（如植物蛋白(bai)定量用植物源(yuan)BSA）。

2、空白(bai)對照(zhao)：用稀釋液代(dai)替(ti)蛋(dan)白(bai)作為(wei)空白(bai)，避免試劑(ji)本身(shen)吸光值(zhi)幹擾(rao)。

3、數(shu)據(ju)記(ji)錄：記(ji)錄吸光值(zhi)時保(bao)留三位小數(shu)，提高計算精度(du)。

4、保(bao)存試劑(ji)：BCA工作液(ye)需避光保存，未用(yong)完(wan)的試劑(ji)不可(ke)重復(fu)使(shi)用(yong)。

蛋(dan)白(bai)定量看似(si)簡單，但(dan)細(xi)節(jie)決定(ding)成敗(bai)。掌(zhang)握(wo)原理(li)、選(xuan)擇合適方法並規(gui)範操(cao)作(zuo)，才能(neng)獲(huo)得可(ke)靠(kao)數(shu)據(ju)。希(xi)望(wang)這(zhe)篇(pian)指(zhi)南能為(wei)您(nin)的實驗(yan)設計提供(gong)清晰思路(lu)！