RNA建庫測(ce)序原理及(ji)文庫(ku)的(de)構建

　　mRNA富集

　　在(zai)生(sheng)物(wu)的(de)Total RNA中，mRNA所占比例(li)很低(di)，絕大部(bu)份時核(he)糖體RNA (rRNA)，因(yin)此如(ru)果直(zhi)接(jie)使(shi)用Total RNA進行(xing)測(ce)序，得(de)到的(de)結果必(bi)然是不準確(que)的(de)，因此需(xu)要(yao)先(xian)將Total RNA中的(de)mRNA分類(lei)純(chun)化出(chu)來。

　　轉錄組測序的(de)文庫(ku)根(gen)據待測(ce)樣品的(de)物(wu)種(zhong)分為(wei)真核(he)轉錄組和原核(he)轉錄組。由於真核(he)生物(wu)和原核(he)生物(wu)mRNA結構(gou)不同(tong)，因此在(zai)mRNA富集時所(suo)采(cai)用的(de)方法(fa)也並不相(xiang)同(tong)。

　　真核(he)生物(wu)mRNA中含有(you)polyA尾(wei)結(jie)構(gou)，因此可(ke)以(yi)使(shi)用oligoT與(yu)其特(te)異性(xing)的(de)匹配(pei)，從而(er)在(zai)Total RNA中特(te)異性(xing)的(de)富集mRNA。

　　然而(er)，原核(he)生物(wu)並不(bu)像真核(he)生物(wu)mRNA具(ju)有polyA的(de)結構(gou)，因此，無(wu)法(fa)直接利(li)用oligoT將mRNA純化(hua)出(chu)來，目(mu)前(qian)，提高原核(he)生物(wu)中mRNA的(de)量(liang)，最(zui)主(zhu)要(yao)的(de)方式(shi)是去除Total RNA中rRNA。

　　由於測(ce)序儀器(qi)不能(neng)直接對RNA測序，所以(yi)還要(yao)反轉錄成(cheng)cDNA

　　鏈(lian)特(te)異性(xing)文庫(ku)

　　由於轉錄組文庫(ku)構(gou)建過程(cheng)中要(yao)將mRNA反轉錄為(wei)雙鏈的(de)cDNA，因此，在(zai)測(ce)序時，即(ji)會(hui)同(tong)時得(de)到cDNA雙鏈的(de)序列信(xin)息(xi)，這(zhe)就消(xiao)除了(le)mRNA單鏈(lian)的(de)特(te)性(xing)，無(wu)法(fa)區(qu)分cDNA中的(de)正義鏈(lian)和(he)反義鏈(lian)。

　　因(yin)此提出(chu)了(le)另壹(yi)種(zhong)文庫(ku)構(gou)建方式(shi)，鏈特(te)異性(xing)文庫(ku)，其在(zai)文庫(ku)制備(bei)和測(ce)序中保(bao)留(liu)mRNA 的(de)方向信(xin)息(xi)，使(shi)得(de)有效(xiao)數(shu)據增(zeng)多(duo)，基因表達(da)定量(liang)更準確(que)；基因註釋(shi)更(geng)準確(que)，新(xin)基因識(shi)別等(deng)分(fen)析(xi)更可(ke)靠(kao)；同(tong)該(gai)方法(fa)能夠(gou)鑒(jian)定與(yu)開(kai)放(fang)閱(yue)讀(du)框反義的(de)ncRNA、發(fa)現反義轉錄本(ben)。

　　其建庫原理與(yu)普(pu)通(tong)轉錄組類(lei)似(si)，不同(tong)之處在(zai)於(yu)合(he)成第二鏈cDNA時，用dUTP代替(ti)dTTP，此時第(di)二鏈cDNA上布(bu)滿(man)了(le)含dUTP的(de)位點(dian)。

　　在(zai)接(jie)頭連(lian)接(jie)後(hou)用壹種(zhong)特(te)定的(de)酶，其可(ke)在(zai)尿(niao)嘧(mi)啶位置(zhi)產(chan)生壹(yi)個單(dan)核(he)苷(gan)酸(suan)缺(que)口，從而(er)消(xiao)化(hua)掉(diao)第(di)二鏈cDNA，只(zhi)保(bao)留(liu)第(di)壹鏈cDNA，隨(sui)後(hou)進行(xing)PCR擴增(zeng)純(chun)化，得(de)到只(zhi)含第(di)壹鏈cDNA信息(xi)的(de)文庫(ku)。